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Cre/loxp重组系统应用实例

作者:山东维真生物科技有限公司 2022-07-27T11:20 (访问量:8038)

维真生物可为您提供Cre/loxP系统控制的各种荧光蛋白,光遗传,化学遗传等多种工具载体以及慢病毒、腺病毒和AAV产品,并提供Cre/loxP系统控制的基因表达、shRNA载体构建及定制病毒包装服务。

 

维真Cre/LoxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务

维真Cre/LoxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务

01 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统

结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型,维真提供的FLEX-ON系统能帮您获得更精准的组织特异性控制和时间控制。

在FLEX-ON系统中,目的基因反方向位于启动子下方,两侧分别连接两个“头对头”的loxP。Cre重组酶不存在时,目的基因不能表达;当Cre重组酶存在时,可以诱导目的基因的“翻转”,从而表达。

图1. 维真提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图(左);
维真FLEX-ON实验图(右)

 

02 依赖Cre重组酶反式剪接系统 —— 轻松拥有“表达大基因的AAV”

较小的包装能力(小于5kb)使得AAV应用受到限制。维真为您提供依赖Cre的反式剪接系统,让您轻松拥有“表达大基因的AAV”。

多个重组AAV的共转染效率高达90%,维真将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上。通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre/LoxP消除ITR对转录的抑制作用,实现目的蛋白的表达。相比于单个载体,维真提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20%。


图2. 维真生物提供依赖Cre的反式剪接系统示意图(左);
维真生物的依赖Cre的反式剪接系统实验图

 维真Cre/LoxP重组系统成功案例分享

 

01 “A cortico-basal ganglia-thalamo-cortical channel underlying short-term memory”(点击查看原文)

 

短时记忆(STM)指在一段较短的时间内储存少量信息的记忆系统,在日常学习和决策等方面具有重要作用。在STM中,神经元表现出持续性的兴奋或抑制活动,这种持续性活动涉及多个脑区,但这些脑区网络如何相互作用以促进选择性持续活动仍是未知的。多项研究表明,皮层-基底神经节-丘脑-皮层(CBTC)神经环路在运动功能中发挥重要作用,该环路若发生功能障碍则会导致严重的运动障碍,如帕金森病和亨廷顿舞蹈症。然而,CBTC环路在认知功能中的作用尚不明确。
本研究中,作者利用光遗传干扰、多通道电位记录和定量小鼠行为测试等方法,详细探索了CBTC环路在短时记忆中的作用,揭示了CBTC通路在短期记忆中产生选择性持续活动的功能,对未来相关神经类疾病的治疗提供了一种新思路。

病毒产品

AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP

AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry

实验动物

Gad2-IRES-Cre 小鼠

注射部位

SNr或TRN区

注射量

100 nL

注射速率

10 nl/min

 

研究者首先确立基底节系统对STM的重要性。在延迟反应任务中,小鼠的胡须在采样区间接受两种不同的扰动,在短暂的延迟后小鼠需要根据胡须刺激的强弱有选择性地舔左边或右边的水嘴来获取奖赏。在采样区间,既没有感觉信息的输入也没有运动信息的输出,因此该时间段编码了短时记忆。研究者采用光遗传技术,将CRE依赖的AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry和AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP先后注入Gad2-IRES-Cre转基因小鼠基底节输出核团黑质网状部SNr通过光纤照射丘脑VM(腹内侧)在短时记忆区间特异性地激活或抑制SNr到VM的投射同时发现光遗传操控特异地影响小鼠的选择偏好性,激活左半脑的投射产生对同侧的偏好性,抑制则产生对对侧的偏好性说明基底节系统对工作记忆有重要作用。

图3. SNr-丘脑通路对短记忆至关重要

 

02 “Multi-omics analysis identifies FoxO1 as a regulator of macrophage function through metabolic reprogramming”(点击查看原文)

 

巨噬细胞是宿主防御机制的中枢效应细胞,可以吞噬和消化杂质、死亡细胞和病原体,在先天性和适应性免疫反应的协调中发挥重要作用。巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体,可以根据生物能量或生物合成的需要在M1型和M2型两种表型之间切换。已知巨噬细胞中的代谢通路变化调节其表型和功能。然而,巨噬细胞代谢重编程的转录机制尚不清楚。转录因子叉头盒蛋白1(FoxO1)是叉头盒蛋白家族的一员,在炎症、代谢、信号转导等一系列细胞过程中发挥着重要作用,已有研究表明,FoxO1在调节巨噬细胞功能中起着关键作用,FoxO1可以通过上调主要组织相容性复合体II(MHC-II)表达,调节感染中的巨噬细胞极化,并促进肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的抗肿瘤功能,但对其在巨噬细胞代谢和功能中的作用知之甚少。

本研究中,作者确定了FoxO1是通过代谢重编程调节巨噬细胞功能的。首先通过培养FoxO1敲除(FoxO1mKO)小鼠及其同窝小鼠的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs),并利用转录组学和蛋白质组学进行分析,发现缺乏FoxO1导致巨噬细胞呈M2样表型,同时炎症反应和迁移相关基因的表达降低。进一步利用高通量筛选分析技术发现FoxO1缺失的巨噬细胞迁移速度减缓、抗肿瘤功能受损。此外,基因富集分析显示FoxO1缺失的巨噬细胞糖酵解相关基因表达减少,与M2样巨噬细胞表达模式相似;进一步研究发现FoxO1缺失的巨噬细胞糖酵解被抑制,导致其功能改变和肿瘤抑制能力降低,表明FoxO1通过代谢调节巨噬细胞功能。本研究表明FoxO1在代谢和巨噬细胞功能之间起桥梁作用。

 

病毒产品

Ad5-CMV-Cre-GFP

感染细胞

小鼠骨髓源性巨噬细胞BMDMs

MOI

400

 

如下图所示,使用腺病毒Ad5-CMV-Cre-GFP感染FoxO1fl/fl 小鼠巨噬细胞,成功使FoxO1基因表达受限,同时糖酵解关键基因PKM2、HK2、Glut1、Eno1等表达均降低,糖酵解活性下降,并与M2巨噬细胞糖酵解基因表达模式相似。


图4. Ad5-CMV-Cre-GFP敲除巨噬细胞中FoxO1后糖酵解相关基因的表达

 

03

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