首先，研究人员对西方饮食喂养的ApoE ^-/-小鼠的主动脉内皮细胞（ECs）进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，证实了ECs间充质转化相关基因的表达上调，并将ECs分为两个亚群，即EC1和EC2（内皮样细胞和间充质样细胞），在动脉粥样硬化小鼠中，EC2数量增多。此外，研究人员在ECs中检测到转录因子SOX4水平升高，基因相互作用及基因调控网络分析显示SOX4的上调促进EndoMT。通过体内外验证SOX4的过表达影响，进一步证明了SOX4的促EndoMT和促动脉粥样硬化作用，二甲基双胍给药可逆转细胞因子诱导的SOX4上调。最后，研究人员确定了除了细胞因子介导的生化刺激外，血流震荡剪切力（OSS）诱导的机械刺激对SOX4水平同样具有促进作用。

通过对ApoE ^-/-小鼠的主动脉内皮细胞进行单细胞RNA测序及分析，研究人员确定了动脉粥样硬化内皮细胞存在EndoMT过程，根据转录组谱分离出两个EC亚群(EC1和EC2)，并发现在西方饮食（WD）诱导的动脉粥样硬化中EC2细胞数量居多。

接下来，研究人员对介导动脉粥样硬化的转录因子进行了检测，发现在WD喂养的ApoE ^-/-小鼠内皮细胞亚群中，SOX4表达上调，并伴有间充质转化相关基因的富集。进一步分析显示SOX4是间充质标记物(VIM和FN1)的上游调控因子，SOX4与间充质基因的直接靶向调控关系在WD喂养的ApoE ^-/-小鼠主动脉根部以及人类动脉粥样硬化冠状动脉和肾动脉中得到验证。

2. SOX4的过表达促进动脉粥样硬化发展和EndoMT

为进一步了解SOX4在动脉粥样硬化中的具体作用，研究人员在WD喂养之前将AAV1-SOX4经尾静脉注射到ApoE^-/-小鼠体内，经检测，SOX4在ApoE^-/-小鼠主动脉中成功过表达。SOX4的过表达不仅增加了ApoE ^-/-鼠面主动脉和主动脉根部的病变区域，还导致内皮细胞标志物(eNOS和PECAM-1)的表达降低和间充质标志物(VIM)的表达增加。此外，体外腺病毒介导的SOX4过表达在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人主动脉内皮细胞(HAECs)中产生了相似的结果。另一方面，SOX4的过表达造成了内皮细胞的形态改变以及功能损伤。上述结果提示，SOX4具有促动脉粥样硬化的作用，且与SOX4介导的EndoMT有关。

3. 二甲双胍抑制细胞因子介导的SOX4上调

随后，研究人员对SOX4的潜在诱导剂和抑制剂进行了探索。据报道，细胞因子IL-1β和TGF-β1可在动脉粥样硬化过程中诱导EndoMT，在免疫细胞(如T细胞)中SOX4已被证明是这两种细胞因子的下游靶点。然而，IL-1β和TGF-β1是否作为SOX4介导内皮细胞EndoMT的上游诱导因子有待进一步探究。研究者通过体外实验证实IL-1β可诱导人肾动脉和ApoE^-/-鼠主动脉SOX4的表达以及EndoMT。同时，IL-1b和TGF-b1两种细胞因子共同作用可显著增加HUVECs中SOX4的蛋白表达和EndoMT。值得注意的是，使用降糖药物二甲双胍（先前报道在肿瘤中作为SOX4的抑制因子）治疗可逆转HUVECs中细胞因子诱导的SOX4表达升高和EndoMT。此外，siRNA介导的SOX4敲除也逆转了HUVECs中细胞因子诱导的EndoMT。

4. 震荡剪切力（OSS）诱导的SOX4上调

由于动脉粥样硬化斑块和动脉瘤往往发生于血流紊乱的血管区域，并且SOX4在OSS区高表达，研究人员推测SOX4除了对细胞因子介导的生化刺激敏感外，还可能对血流诱导的机械刺激敏感。相对平直的TA（胸主动脉）和弯曲的AA（主动脉弓）分别对应LSS（层流切应力）和OSS，研究者分别检测了TA区和AA区的SOX4水平。结果发现位于AA区域的ECs中SOX4的表达量增加，同时AA中SOX4的整体表达量也更高。此外，研究者进一步验证了体外受OSS刺激的HUVEC中的SOX4水平，发现暴露于OSS 24小时后，HUVECs细胞中SOX4在转录和翻译水平上均增加，与体内结果相一致。

图5. 震荡剪切力（OSS）诱导的SOX4上调

综上，本研究利用单细胞RNA测序揭示了小鼠动脉粥样硬化主动脉的细胞组成和转录图谱，SOX4被鉴定为人类和小鼠动脉粥样硬化的新型标记物，并明确了高脂血症相关细胞因子和震荡剪切力是介导SOX4上调的诱导剂，同时二甲双胍可以抑制细胞因子诱导的SOX4上调。本研究为探究动脉粥样硬化疾病的进展和治疗提供了新的见解。