DsDD cDNA Subtraction Kit Wako双链特异性直接消化cDNA削减试剂盒

Simple and quick enrichment of specifically expressed genes 

TIBCO削减法杂交法是一种利用组织特异性显现，鉴定基因的有效方法之一。迄今为止有各种各样不同的方法被提出，然而，无论哪种方法的操作都较为烦杂且作业工序多，需要时间和高技术。而且，cDNA Library 不能用于作为启发材料，因而每次都不得不用mRNA准备Tester及Driver cDNA。

DsDD（Duplex-specific Direct Digestion）cDNA Subtraction Kit Wako 是以cDNA library 的调制为基础，运用减去法调制Tester 及Driver cDNA。再利用Tester及cDNA 显现组织的非特异性，形成高品质的基因同伴。在二条链的特异性DNA核酸酶存在的情况下，利用Duplex-specific nuclease,分解杂化的DNA。之后，利用ExonucleaseⅠ 分解除去在Tester cDNA中特异显现的残留Drive cDNA，以实现cDNA高效浓缩。

在解析癌细胞组织特异性机能和性质时，Tester cDNA 由癌细胞组织调制，Driver cDNA由正常细胞组织调制，浓缩来自基因的cDNA，可显现癌细胞组织的特异性。DsDD cDNA Subtraction Kit Wako中的cDNA Library 可用于作为起动材料，此方法的全部工序可在2天完成，是划时代的技术。

【试剂盒内容】

【试剂盒原理】

注意Tester cDNA Library及Driver cDNA Library。

对于cDNA媒介物，Tester使用同一方向插入的cDNA Library。

1.        Tester Library（异常）→DNA放大 →由Library 放大的Tester dsDNA.

  Driver Library（正常）→DNA放大 →由Library 放大的Diver dsDNA.

2.        Tester DNA的调制：

         使用仅一侧磷酸化的cDNA程序库，用启发剂进行DNA放大，经Lambda Exonuclease 处理，调制出1条链cDNA。

注1）   Tester cDNA放大。

DNA放大时，对附带磷酸的5ˊ末端使用启发剂。

注2）    Lambda Exonuclease 处理。

识别2条链DNA的5ˊ磷酸末端，由5ˊ→3ˊ方向分解。如果无法形成高品质的Tester同伴，可适当提高减去法效率。 

3.        Driver DNA的调制：

      使用cDNA程序库进行DNA放大，将multi-Croning两侧的部分部位用限制酶处理。

注3）制限酶处理：

除去两端的接合部分，以防止杂交时的差错及杂化。 

4.        杂交：

Tester cDNA和Driver cDNA在68℃情况下反应16--20小时。(混合比为1：200)过量的Driver cDNA与除特异性基因以外的Tester cDNA大部分形成dsDNA。

注4）热变性后，Tester ss cDNA 和Driver ds cDNA不进行杂交。

5.        DSN处理：

利用DSN作用于2条链的特异性，分解除去杂化形成的2条链cDNA。

注5）进行高特异性反应，其反应温度高于68℃。

6.        DNA放大

7.        Exonuclease I 处理

利用Exonuclease I 分解除去未形成杂化的残留Driver ss cDNA。使用酶切断特异性1条链DNA。除特异性基因以外的一条链状态全部分解。自实验开始起2天内，即可得到高效率的Subtracted cDNA。